ELISA试剂盒组成实验原理及步骤

ELISA试剂盒组成实验原理及步骤

   酶联免疫吸附实验（ELISA）是一种免疫分析方法，它将抗原或抗体结合在固相载体表面，利用抗原抗体的特异性结合，以及标记酶的抗体（或抗原）与底物反应产生的信号来检测目标物。

 

ELISA实验原理:

这里以ELISA（双抗体夹心法）说明，基本原理是利用抗原与抗体的特异性结合反应。该方法主要包括以下步骤：

包被:将捕获抗体固定在固相载体（例如96孔板）表面。

封闭:用不相关的蛋白质溶液封闭固相载体上未结合的位点，以减少非特异性吸附。

加样:将待测样品加入孔中，使样品中的目标抗原与捕获抗体结合。

洗涤:洗去未结合的抗原和其他物质。

加酶标抗体:加入与目标抗原另一表位结合的酶标检测抗体。

洗涤:洗去未结合的酶标抗体。

加底物:加入酶的底物，酶催化底物发生反应，产生可检测的信号（例如颜色变化、发光或荧光）。

检测:使用酶标仪检测信号强度。通过与标准曲线比较，可以定量测定样品中目标抗原的浓度。

ELISA除了双抗体夹心法，还有直接法、间接法和竞争法，因为篇幅有限，不做重点解释。其原理大致相同，步骤有所区别。

ELISA试剂盒的典型组成:

一个标准的ELISA试剂盒通常包含以下组件：

1、预包被微孔板： 96孔或48孔塑料板，孔内已预先包被好捕获抗体或抗原（根据类型而定）。这是反应发生的场所。

2、酶标二抗（或酶标检测抗体/抗原）： 根据ELISA类型，提供辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的二抗（用于间接法或夹心法），或酶标抗原（用于竞争法）。

3、标准品： 已知精确浓度的抗原（或抗体）系列梯度溶液。用于绘制标准曲线，计算样本中待测物的浓度。

4、检测抗体（仅夹心法）： 未标记的、针对抗原另一表位的抗体。

5、样品稀释液： 用于稀释样本，使其基质与标准品和缓冲体系匹配，减少非特异性干扰。

6、洗涤缓冲液： 通常为含吐温-20的磷酸盐缓冲液。用于在各步骤之间洗去未结合的物质，减少背景干扰。洗涤是否彻底是实验成败的关键！

7、封闭液： 常用牛血清白蛋白或脱脂奶粉溶液。用于在包被后封闭微孔板上未结合的位点，防止后续步骤中的非特异性吸附，降低背景。

8、底物溶液：

对于HRP：常用四甲基联苯胺或3,3',5,5'-四甲基联苯胺。

对于AP：常用对硝基苯磷酸酯。

9、终止液：

对于HRP-TMB：常用稀硫酸溶液。

对于AP-pNPP：常用氢氧化钠溶液。用于终止酶促反应，稳定最终颜色。

10、板封膜： 在孵育步骤中覆盖微孔板，防止蒸发和污染。

11、说明书： 详细的操作步骤、试剂保存条件、注意事项、预期结果和标准曲线绘制方法等。

操作步骤：